RSD檢測原理
表面等離子共振( surface p lasmon resonance, SPR)型免疫傳感器,是利用SPR技術(shù)作為檢測免疫分子間反應(yīng)的一種光學(xué)免疫傳感器。表面等離子體共振發(fā)生在介電常數(shù)不同的兩個介質(zhì)界面上,是入射光的電磁波和金屬表面的自由電子形成的電荷密度波相互作用所產(chǎn)生的一種電荷密度振動。這種沿著金屬表面?zhèn)鞑サ碾姾擅芏炔ū环Q為表面等離子體波( SPW) ,它在金屬內(nèi)部的振幅是隨著與表面垂直方向呈指數(shù)衰減 。根據(jù)Mexwell方程,可以得到SPW的波矢Ksp :
式中εm 是金屬的介電常數(shù),εa 是被測物的介電常數(shù),ω為入射光的角頻率, c為入射光在真空中的波
速。當(dāng)水平偏振的入射光通過一個棱鏡照射到金屬表面時,入射光波矢在X軸上的投影Kx :
εp為棱鏡介電常數(shù),θ為入射角。如果入射光波矢在X 軸上的投影Kx 等于SPW的波矢Ksp ,入射光就
會在金屬表面引起表面等離子體共振。入射光的大部分能量被SPW吸收后轉(zhuǎn)化為熱量,使反射光能量
急劇下降,可在反射光譜上出現(xiàn)反射強度最低值(即共振峰) 。如果與金屬表面接觸介質(zhì)的折射率或被
測物介電常數(shù)發(fā)生變化,共振峰的位置(共振角或共振波長)將發(fā)生改變,因此通過測定共振角或共振
波長變化,就可獲得被測物在界面上發(fā)生反應(yīng)的信息 。在該原理基礎(chǔ)上,通過在等離子共振裝置反
應(yīng)界面上修飾一層抗體分子,當(dāng)抗原抗體識別后,共振峰的位置會發(fā)生位移,該位移的大小將反映固定
在金屬表面的生物分子的量,進(jìn)而實現(xiàn)免疫分析。
免疫傳感器的構(gòu)建
早在1982年Nylander等[ 9 ]就預(yù)言,基于SPR技術(shù)的生物傳感器將是最具商業(yè)化潛力的一類傳感
器。近年來,各種商品化的SPR型免疫傳感器在免疫傳感器的應(yīng)用領(lǐng)域中已經(jīng)成為最活躍的一個分
支。SPR型免疫傳感器主要包括光波導(dǎo)器件、金屬薄膜和生物敏感膜3部分。生物敏感膜的構(gòu)建是決
定免疫分析的關(guān)鍵。在金屬表面構(gòu)建生物敏感膜一般有直接吸附和共價連接2種方式。
2. 2. 1 金屬膜對免疫分子直接吸附 該方式最早被用于SPR型免疫傳感器生物膜的構(gòu)建[ 10 ] ,其缺點在于:
(1)免疫分子無法在金屬表面形成穩(wěn)定的生物敏感膜,致使其在金屬表面覆蓋率較低;
(2)固定在金屬表面的免疫分子由于空間位阻效應(yīng)可能損失部分活性;
(3)直接吸附法構(gòu)建的生物敏感膜存在較大的非特異性吸附。
2. 2. 2 共價連接法 Morgan等[ 11 ]利用生物素和抗生物素蛋白鏈菌素能特異性結(jié)合的特點,利用共價結(jié)合方式構(gòu)建了免疫傳感器。首先在金屬表面覆蓋一層生物素,然后固定一層抗生物素蛋白鏈菌素,再將免疫分子固定在抗生物素蛋白鏈菌素層上。通過這種方法構(gòu)建的生物敏感膜可降低金屬表面的非特異性吸附,大大提高分析的特異性和準(zhǔn)確性。也可采用葡聚糖法固定免疫分子,在鍍金薄膜上通過烷基
巰醇形成親水的自組裝單層膜,然后通過環(huán)氧氯丙烷將羧甲基葡聚糖共價結(jié)合到巰醇自組裝層上,用碘
乙酸處理葡聚糖使之產(chǎn)生羧基,之后用N2羥基硫代琥珀酰亞胺和12乙基232(32二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽活化羧基,使活化的羧基與免疫分子的功能基團(tuán)(如氨基)結(jié)合而達(dá)到固定免疫分子的目的[ 12 ] 。比較而言,羧甲基葡聚糖共價結(jié)合法在商品化SPR型免疫傳感器制備中應(yīng)用率最高。原因在于,有序自組
裝層能阻礙生物分子與金屬表面的直接接觸,降低非特異性吸附,同時可通過自組裝層功能基團(tuán)進(jìn)一步
衍生化,人工設(shè)計構(gòu)建生物膜結(jié)構(gòu), 提高傳感器識別能力。
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