基于高內(nèi)涵顯微成像流式細胞儀的免疫學(xué)研究方案

感染時初始CD8+T細胞被激活、增殖分化為效應(yīng)CD8+T細胞，并伴隨體溫升高。要知道體溫升高是否會進一步調(diào)控CD8+T細胞的激活分化，首先要解決對T細胞激活分化過程中的形態(tài)學(xué)變化進行定量分析。

Amnis公司ImageStream高內(nèi)涵顯微成像流式細胞儀結(jié)合熒光顯微鏡和流式細胞儀的優(yōu)點，可在快速分析大量細胞的同時獲得每個細胞的圖像，進行客觀定量的分析。我們知道，發(fā)燒的時候是機體正在對外來病原菌進行抵抗。以往我們只是知道高溫能夠抑制病原菌的復(fù)制能力。但是來自于美國紐約的羅茲韋爾公園癌癥研究所(RPCI)的免疫與流式細胞儀研究組近日的研究表明，發(fā)燒還能夠提高免疫系統(tǒng)的功能，確切的說，是CD8+T細胞的功能[Thomas A. Mace, JLB,2011]。

在這篇研究中，美國Amnis公司的ImageStream高內(nèi)涵顯微成像流式細胞儀發(fā)揮了不可估量的作用，不僅完美的解決了傳統(tǒng)的流式分析和傳統(tǒng)圖像觀察的技術(shù)瓶頸，而且其強大的圖像定量分析能力也使之成為免疫學(xué)研究的利器。在炎癥或者受到病原菌侵染的時候，初始CD8+T細胞通過與APC細胞相互作用而被激活，進而增值、分化為效應(yīng)CD8+T細胞，此激活過程可能會伴隨著體溫的升高。但是人們?nèi)圆涣私怏w溫的升高是否又會進一步調(diào)控CD8+T細胞的激活和分化。

要解決這一問題，首先要解決的是如何對T細胞的激活和分化過程中的形態(tài)學(xué)變化進行定量分析。而美國Amnis公司推出的ImageStream高內(nèi)涵顯微成像流式細胞儀使得這一問題迎刃而解：該系統(tǒng)結(jié)合了熒光顯微鏡和流式細胞儀的優(yōu)點，能夠在快速分析大量的細胞的同時獲得每個細胞的圖像，并可以對這些圖像進行客觀、定量的分析。

近日，美國紐約的羅茲韋爾公園癌癥研究所《白細胞生物學(xué)雜志》雜志上發(fā)表了他們的研究結(jié)果：研究者利用ImageStream高內(nèi)涵顯微成像流式細胞儀對較低體溫(33°C和37°C)以及較高體溫(39.5°C)下小鼠CD8+T細胞與APC細胞的結(jié)合情況進行了定量分析，結(jié)果表明，體溫升高后增強了二者的結(jié)合率。

另外更重要的是，研究者還發(fā)現(xiàn)實驗組小鼠CD8+T細胞數(shù)量顯著增加，并且其膜表面的GM1以及CD8共受體聚集成簇從而影響了膜的流動性。這些結(jié)果揭示了發(fā)燒引起的體溫增加能夠通過提高效應(yīng)細胞群體的數(shù)量來影響抗原特異性CD8+T細胞所調(diào)節(jié)的應(yīng)激效應(yīng)。在該研究中，ImageStream顯示了其強大的圖像定量分析能力。

研究者首先從實驗小鼠體內(nèi)分離了初始CD8+T細胞，然后分別在33°C、37°C以及39.5°C孵育6小時后，通過用ImageStream分析其細胞膜的流動性。由于ImageStream能夠?qū)z測到細胞進行成像，所以可以直觀的顯示出FITC標記的GM1蛋白均勻分布或成簇分布的情況(圖1B)。

通過軟件對整個群體細胞進行定量的圖像分析，研究者利用ImageStream軟件中的BrightDetail Intensity參數(shù)對細胞進行分析，發(fā)現(xiàn)溫度升高至39.5°C后細胞膜表面的GM1成簇現(xiàn)象明顯增加(圖1C)。另外，有報道表明T細胞激活時TCR信號復(fù)合體也會在細胞膜表面成簇。因此，研究者也對該復(fù)合體進行了分析，同樣獲得了類似的結(jié)果(圖1G和圖H)。

為了檢測溫度是否會影響CD8+T細胞與APC細胞二連體的形成，研究者將初始CD8+T細胞分別在37°或39.5°C 孵育6小時，然后和C57BL/6脾細胞共培養(yǎng)，實驗組用gp10025-33多肽處理。最后用ImageStream對發(fā)生免疫突觸的二連體細胞的數(shù)量進行分析。

首先通過明場和Aspect Ratio(細胞的短軸/長軸)設(shè)門區(qū)分單細胞和二連體細胞(圖2A和B，R1為單細胞，R2為二連體細胞)，然后通過CD8+Thy1.1+ (即 CD8+ T cells)和CD11b+ (即APC) 的表達進行設(shè)門圈選出T細胞和APC的雙聯(lián)體細胞(圖2C)。實驗結(jié)果表明，溫度的升高使CD8+T細胞與APC二連體細胞的比例顯著增加(圖2D)。

圖2.溫度的升高導(dǎo)致CD8+T細胞和APC細胞的二連體的比例增加

接下來，研究者希望探究CD8+T細胞的共受體是否也會隨著溫度的增加而聚集成簇。該共受體分子也和TCRβ一樣，是對CD8+T細胞激活非常重要的分子。通過研究證實了作者的猜測(圖3A和3B)。

圖3.小鼠的升高導(dǎo)致CD8+T細胞膜表面共受體成簇比例增加

同時研究者還利用ImageStream軟件中的Similarity參數(shù)對CD8共受體與GM1在細胞膜共定位情況進行了分析，但是結(jié)果表明小鼠體溫增加前后的similarity值沒有差異(數(shù)據(jù)未顯示)。為了進一步研究GM1在T細胞中的成簇情況，研究者分析了GM1和陰性對照CD71的共定位情況，結(jié)果表明在小鼠體溫增加前后similarity的值有所下降(右圖C和D)。圖像顯示CD71分子在小鼠體溫升高后并沒有和GM1共成簇(cocluster)，如右圖E所示。

最后，研究者認為CD8+T細胞及其分化為效應(yīng)細胞的過程是對溫度敏感的。如果CD8+T細胞先處于較高的溫度下，然后接受到抗原刺激時會更加快速和有效的作出響應(yīng)。在此類免疫學(xué)研究中，研究者遇到的最大的技術(shù)瓶頸就是如何對大量的細胞圖像進行定量分析并且獲得具有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)—因為傳統(tǒng)的流式細胞儀無法獲得細胞的形態(tài)學(xué)信息，而采用熒光顯微鏡需要通過人為進行判斷分析，統(tǒng)計的細胞數(shù)量非常有限。而美國Amnis公司推出的ImageStream高內(nèi)涵顯微成像流式細胞儀完美的解決了這一問題，能夠快速、客觀的對蛋白轉(zhuǎn)位、分子共定位、形態(tài)改變、分子內(nèi)吞、免疫突觸形成等形態(tài)學(xué)進行定量分析。