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[導(dǎo)讀] 介紹一種以透射比濁法為設(shè)計(jì)原理,單片機(jī)89C52為核心的96通道高速抗凝血藥物篩選平臺。

 介紹一種以透射比濁法為設(shè)計(jì)原理,單片機(jī)89C52為核心的96通道高速抗凝血藥物篩選平臺。

該儀器自動完成血液(血漿)凝血時(shí)間的實(shí)時(shí)檢測及數(shù)據(jù)采集,數(shù)據(jù)采集的精度、速度及靈敏度較傳統(tǒng)的凝血時(shí)間測量儀器有較大的提高。提出了將凝血時(shí)間測量用于相關(guān)藥物篩選的新途徑。

血液凝固的過程非常復(fù)雜的。生物體在正常生理狀態(tài)下,血液中的凝血系統(tǒng)與抗凝血系統(tǒng)處于自我調(diào)節(jié)的一種平衡狀態(tài),如果這種平衡被破壞,就會形成凝血系統(tǒng)疾病?,F(xiàn)在臨床上最常用的抗凝血類藥物是肝素,這種藥物雖然有很好的抗凝血效果,卻伴隨著血和血小板減少等副作用,而且當(dāng)患者本身患有彌散性血管內(nèi)凝血等疾病時(shí)便無法采用。現(xiàn)有的口服類抗凝血藥物(如節(jié)丙酮香豆素[1])的使用效果又不甚理想。因此,新型抗凝血藥物的研制工作是非常必要的。

進(jìn)行抗凝血藥物開發(fā)的第一步就是要檢驗(yàn)藥物的抗凝效果,也就是凝血時(shí)間的檢測?,F(xiàn)在際上普通認(rèn)可的測量凝血時(shí)間的指標(biāo)主要有兩個:凝血酶原時(shí)間(Prothrombin Time,PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(Actived Partial Thromboplastin Time,APTT)。這兩個指標(biāo)是

由國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(ICSH)、估計(jì)血檢與止血委員會(ICTH)和美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)聯(lián)合制定分布的[2]。PT和APTT不僅能取代傳統(tǒng)的Duke法出血時(shí)間和玻片法凝血時(shí)間而作為新的臨床止血功能指標(biāo),并且能為抗凝血藥物開發(fā)過程提供更好的監(jiān)控指標(biāo)。

正常的凝血過程時(shí)間很短,即使加入抗凝劑,也不會超過1分鐘。正常情況下,PT不會超過20秒,這給手工測量帶來了很大的困難。為了尋求方便的檢測途徑,國內(nèi)外許多企業(yè)已經(jīng)開始研制相關(guān)的自動化凝血時(shí)間測量儀,并且已經(jīng)投

放市場如德國TECO公司的TEChrom IV plus 4通道半自動血栓/止血測定儀;法國BIOCHEM公司STAGO全自動血栓/止血分析儀等。這些凝血測量儀雖然可以完成一個或幾個樣品的同時(shí)檢測,但是仍然沿用臨床檢測的套路,檢測速度有限,樣品用量比較大,樣品波大都固定于儀器上,清洗不方便,同時(shí)價(jià)格也相當(dāng)昂貴,不適用于藥物開發(fā)。

為了提高凝血測量儀的性能,同時(shí)滿足高通量的藥物篩選的需求,我們利用單片機(jī)設(shè)計(jì)了一套新型的凝血時(shí)間自動檢測儀,目的在于為新藥開發(fā)質(zhì)量控制提供便利。這臺小型的凝血時(shí)間測量裝置(體積僅30cm×20cm×12cm)不僅能夠進(jìn)行96路并行實(shí)時(shí)檢測,而且樣品用量少(20μl),靈敏度高(0.1秒),具有很好的應(yīng)用前景。

1 測量原理

血液的凝固從物理上來講就是非溶性纖維蛋白形成的過程,而且在很短的時(shí)間內(nèi)非溶性纖維蛋白的數(shù)量會陡然增加。這樣,整個血液的透光率就會迅速降低(濁度升高),一段時(shí)間后就會漸漸變緩。通常我們所測量的凝血時(shí)間也就是指非溶性纖維蛋白形成的起始階段,即濁度變化達(dá)到三倍信澡比的時(shí)間。

透射比濁法正是利用了血液在凝血過程中濁度突然升高的原理來設(shè)計(jì)的。只要檢測器件具有足夠的靈敏度,就可以檢測出血液凝固的時(shí)間。

2 檢測儀設(shè)計(jì)

2.1 樣品池設(shè)計(jì)

檢測儀采用標(biāo)準(zhǔn)平底透明96孔板作為樣品池,其上、下方分別為一一對應(yīng)光敏二極管和發(fā)光二極管,樣品池采用抽屜式結(jié)構(gòu)。每次使用可以將抽屜拉出,放上96孔板,再加入凝血試劑和血液(血漿),然后啟動檢測開關(guān),開始數(shù)據(jù)采集。

2.2 電路設(shè)計(jì)

由于通過光敏二極管接收到的電壓信號變化量往往比較低(幾個mV),對于光源手檢測器件的選擇至關(guān)重要的。因此,在儀器設(shè)計(jì)以前,首先選用了幾個不同的發(fā)光二極管(以下簡稱LED)和與其對應(yīng)的光敏二極管對凝血過程透光率進(jìn)行了實(shí)測相應(yīng)的理論計(jì)算。

 


 

圖1所示為光敏二極管的基本電路。二極管兩端的電流為:

 


 

式中,I為通過不敏二極管的電流,Is為反向飽和電流,VD為二極管兩端電壓,VT=kT/q稱為混度進(jìn)行當(dāng)量,其中k為玻爾茲曼常數(shù),T為熱力學(xué)溫度,q為電子的電量。在300K時(shí),VT≈26mV。反向偏置時(shí),只要|VD|大于VT幾倍以上,I=-Is,其中負(fù)號表示反向電流。

實(shí)驗(yàn)證明,光敏二極管的反向電流在一定范圍內(nèi)與LED上的加載電壓存在正比的函數(shù)關(guān)系,如圖2所示。這是因?yàn)長ED正常發(fā)光過程中,LED加載電壓與輸出光強(qiáng)存在正比關(guān)系;光敏二極管的反向電流與其吸收光強(qiáng)也存在正比的函數(shù)關(guān)系。根據(jù)這一點(diǎn)我們可以做如下推斷:

假設(shè)通過光敏二極管的吸收光強(qiáng)為φ,則

I=-Is=Cφ+m≈Cφ

其中,C與m為僅隨溫度而變化的因子,m≈0。

 


 

與光敏二極管串聯(lián)的電阻R兩端電壓V=IR=CφR,并有:φ=φ0+Δφ,V=V0+ΔV,V0=CRφ0, ΔV=CRΔφ。其中,V0和φ0為凝血反應(yīng)開始之前R電阻兩端的電壓與光敏二極管的吸收光強(qiáng)。

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