對DNA-蛋白的結(jié)合親和力進行定量測定的HiTS-FLIP新技術(shù)

麻省理工學(xué)院的研究人員利用新一代測序儀，開發(fā)出一種名為HiTS-FLIP的新技術(shù)，能以前所未有的深度對DNA-蛋白的結(jié)合親和力進行定量測定。新一代測序技術(shù)自問世以來，為生物學(xué)帶來了深刻的變化。它極大地推動了非模式物種的全基因組測序工作，越來越多的物種基因組信息相繼公布。同時，通過基因組重測序，人們可以了解到單核苷酸多態(tài)性、突變熱點、基因組結(jié)構(gòu)變異、群體多態(tài)性等重要信息。此外，新一代測序還廣泛應(yīng)用在宏基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組研究。然而，它的應(yīng)用可不可以再廣一些呢？

麻省理工學(xué)院（MIT）的Christopher Burge及其同事也在思考這一問題。幾年前，MIT購入了Illumina的測序儀。該儀器有著很好的微流體學(xué)和高端的照明及成像系統(tǒng)。于是，他們打算用它來試著研究DNA與蛋白質(zhì)的相互作用。他們的想法是，將熒光標(biāo)記的蛋白直接放入流動槽。如果這種熒光標(biāo)簽與測序所使用的一種熒光dNTP匹配，那么你可以讓儀器對它成像，就好像對另一個堿基成像，你也可以看到蛋白所結(jié)合的DNA簇，并根據(jù)信號強度判斷結(jié)合有多強。他們開發(fā)出的這種技術(shù)稱為高通量測序-熒光配體相互作用圖譜分析（HiTS-FLIP）。

研究小組將HiTS-FLIP技術(shù)應(yīng)用到酵母轉(zhuǎn)錄激活因子Gcn4上。首先，研究人員制備了一個隨機25聚體的DNA文庫，將其放入儀器，并開展測序步驟。之后他們通過變性，剝離了非天然鏈，利用新的引物和Klenow合成了新的DNA。他們再加入與單體(m)Orange結(jié)合的GCN4，并對結(jié)合的蛋白成像。最后，他們在簇測序圖像上疊加了蛋白結(jié)合熒光圖像。簇大小的強度校正讓他們能夠預(yù)測特定序列的內(nèi)在親和力。之后，他們還與Illumina的研究小組合作，從數(shù)據(jù)中獲得了解離常數(shù)。這是很多測定相互作用的方法無法實現(xiàn)的。

除了能夠測定解離常數(shù)，此方法還有其他優(yōu)點。由于流動槽表面的低背景，成像前的洗滌步驟可限制在2分鐘。相比之下，蛋白結(jié)合芯片需要20分鐘的洗滌步驟，才能去除許多弱的結(jié)合相互作用。同時，測量深度也有很大提高。在25聚體的背景下，他們獲得了每個7聚體的蛋白結(jié)合親和力的10萬次測定以及每個12聚體的500次測定。它所實現(xiàn)的分析深度能夠讓研究人員了解不同位置上殘基之間的復(fù)雜相互依存關(guān)系。通過捕獲弱及復(fù)雜的相互作用，該數(shù)據(jù)有助于GCN4結(jié)合的預(yù)測，并揭示出有著不同表達動力學(xué)的GCN4調(diào)控啟動子。這些數(shù)據(jù)顯示motif位置之間存在復(fù)雜的相互依存，能夠更好地區(qū)分體內(nèi)Gcn4p結(jié)合位點和調(diào)控靶點，并顯示與Gcn4p有著不同的啟動子親和力的基因有著不同的功能和表達動力學(xué)。