一文讀懂多器官微流控芯片技術(shù)發(fā)展

微流控芯片技術(shù)(Microfluidics)也被稱為芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab-On-a-Chip, LOC)，涉及物理、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、電子、材料、機(jī)械等多學(xué)科交叉的研究領(lǐng)域。通過微通道、反應(yīng)室和其他某些功能部件，對流體進(jìn)行精準(zhǔn)操控，對生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)分析過程的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成分析，具有液體流動可控、集成化、消耗低、通量高、分析快等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等研究領(lǐng)域?；谖⒘骺匦酒夹g(shù)的人體器官芯片(Human organs-on-chips)近幾年來發(fā)展迅速，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)肺、腎、腸、肝、心臟、血管、皮膚、大腦、骨骼、乳腺、脾臟、血腦屏障、氣血屏障等芯片的構(gòu)建，通過與細(xì)胞生物學(xué)、工程學(xué)和生物材料等多種學(xué)科的方法相結(jié)合，體外模擬多種活體細(xì)胞、組織器官微環(huán)境，反映人體組織器官的主要結(jié)構(gòu)和功能特征。

人體不同器官或整個系統(tǒng)的毒性檢測是藥代動力學(xué)和藥效學(xué)研究的重要部分，傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)模式以及動物實(shí)驗(yàn)取得了諸多成就，但受周期、成本、精準(zhǔn)度、倫理等因素的限制，難以預(yù)測人體對于各種藥物的響應(yīng)。研究表明：人體器官芯片技術(shù)能準(zhǔn)確地控制多個系統(tǒng)參數(shù)，與傳統(tǒng)的毒理學(xué)動物實(shí)驗(yàn)相比更能反映人體內(nèi)真實(shí)情況，在新藥篩選方面更具特異性。因此，利用微加工技術(shù)，建立更接近人體環(huán)境的仿生系統(tǒng)成為體外生理模型的研究熱點(diǎn)。

然而，隨著器官芯片技術(shù)的發(fā)展，其應(yīng)用仍然存在一定的局限性，大部分生理途徑需要連續(xù)介質(zhì)循環(huán)和組織間相互作用，單器官芯片無法全面反映機(jī)體器官功能的復(fù)雜性、功能變化和完整性。為適應(yīng)人體結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，δ來的研究需要建立更加復(fù)雜的多器官微流控芯片(Multi-Organ-Chip, MOC)系統(tǒng)，將幾種器官等同物合并到類似人類的代謝環(huán)境中，開發(fā)動態(tài)的實(shí)驗(yàn)室微生物反應(yīng)器，進(jìn)行系統(tǒng)的毒性檢測和代謝評估。

本文綜述了近年來多器官微流控芯片的研究進(jìn)展，并對其發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

多器官微流控芯片的設(shè)計原理

多器官微流控芯片將不同器官和組織的細(xì)胞在芯片上培養(yǎng)，以微通道相連，實(shí)現(xiàn)多器官集成化，以考察其相互作用或建立一個系統(tǒng)，用于體外藥物篩選。芯片中可集成數(shù)個經(jīng)過特殊設(shè)計的微培養(yǎng)室、灌注通道并同時培養(yǎng)多種細(xì)胞，利用微流控技術(shù)可以產(chǎn)生精確可控的流體剪切力、周期性變化的機(jī)械力和溶質(zhì)濃度梯度變化的灌注液。利用這些平臺優(yōu)勢，多器官微流控芯片可以用于細(xì)致地分析組織、器官特異性應(yīng)激反應(yīng)，例如循環(huán)免疫細(xì)胞的募集、對藥物、毒素或其他刺激因素的應(yīng)答等。除此之外，將多個模擬不同器官、組織的芯片，按照體內(nèi)的關(guān)系，用血管內(nèi)皮組織、血細(xì)胞或是流體介質(zhì)將其連接起來，就能在體外模仿體內(nèi)不同器官、組織之間的生理作用和藥物分布等。

圖1所示為 MOC系統(tǒng)裝置，圖1(a)包括兩個聚碳酸酯蓋板，PDMS-玻璃芯片用于承載血流回·(粉紅色)和排泄流動回·(黃色);數(shù)字分別代表腸道(1)，肝臟(2)，皮膚(3)和腎臟(4)組織的4個組織培養(yǎng)隔室。多器官芯片布局的頂視圖示出了血液回·中的3個測量點(diǎn)(A，B和 C)的λ置以及排泄回·中的兩個測量點(diǎn)(D，E)。該裝置用微泵設(shè)備來控制流體的順時針和逆時針流動，以微通道相連接，在芯片上培養(yǎng)構(gòu)建了可容納腸、肝、皮膚、腎4個器官的MOC系統(tǒng)，通過兩個流動回·模擬模擬藥物在腸內(nèi)吸收、肝臟代謝以及腎臟排泄，用于體外檢測候選藥物安全性和有效性評估。應(yīng)用該系統(tǒng)體外模擬了人體內(nèi)葡萄糖代謝的環(huán)境，結(jié)果顯示芯片“口服”藥物，吸收后藥物通過模擬的血液循環(huán)，經(jīng)過肝臟，然后進(jìn)入皮膚和腎臟，到達(dá)腎臟器官模型代謝并經(jīng)腎尿液排出，進(jìn)一步驗(yàn)證了葡萄糖在小腸內(nèi)的代謝途徑。此外，還有相關(guān)研究共培養(yǎng)神經(jīng)球和肝球體，構(gòu)建神經(jīng)系統(tǒng)-肝臟多器官微流控芯片，用2，5-己二酮研究其對組織的毒性作用和代謝途徑，通過測定葡萄糖消耗量和乳酸產(chǎn)量作為MOC系統(tǒng)代謝活動的指標(biāo)。在肝中，正己烷可能以解毒途徑或者生物活化途徑代謝為己醇，經(jīng)過血液到達(dá)大腦產(chǎn)生毒害作用，實(shí)驗(yàn)中對兩種不同濃度的2，5-己二酮的毒性測定結(jié)果表明其誘導(dǎo)了神經(jīng)球和肝微組織中的高度細(xì)胞凋亡。

多器官微流控芯片系統(tǒng)研究

微細(xì)胞培養(yǎng)物類似物(μCCA)與PBPK模型

藥代動力學(xué)模型(Physiologically Based Pharmacokinetics, PBPK)是指一種更符合藥物在體內(nèi)動態(tài)變化的具體狀況的模型，對于新藥研發(fā)具有重要作用。PBPK模型以“生理學(xué)室”代替經(jīng)典模型中的隔室(房室模型)，根據(jù)質(zhì)量平衡關(guān)系、按模型建立速度方程、對方程組進(jìn)行求解、得出各個組織或器官的毒物濃度與時間的關(guān)系，可基本明確藥物在體內(nèi)動態(tài)增加或減少的實(shí)際情況。由于微流體可以精確控制多個隔室的流動和連接，區(qū)域化的微流體系統(tǒng)可以作為PBPK模型的體外平臺。

經(jīng)過對多器官微流控芯片系統(tǒng)的研究，開發(fā)了一種模擬人類對藥物反應(yīng)的高通量體外系統(tǒng)，將基于微流控芯片的微細(xì)胞培養(yǎng)物類似物(Microscale Cell Culture Analog, μCCA)與PBPK模型結(jié)合使用，建立對應(yīng)PBPK數(shù)學(xué)模型的物理裝置(μCCA裝置)。在裝置中，ÿ個器官代表一個隔室，代表關(guān)鍵器官的腔室被制造在硅芯片上，并通過微通道相互連接用于模擬血液流動中的介質(zhì)再循環(huán)，μCCAs縮小器件可以在體外模擬近生理流體流動條件、體內(nèi)組織的尺寸比以及多組織器官的相互作用，通過使用外部泵和外部常見的介質(zhì)再循環(huán)來支持個體肝臟、骨髓和腫瘤細(xì)胞系培養(yǎng)隔室之間的相互作用。在對肝臟、骨髓和腫瘤細(xì)胞系共培養(yǎng)研究中，根據(jù)人類組織數(shù)據(jù)設(shè)置縮放細(xì)胞室及相關(guān)參數(shù)，μCCA裝置中不同組織或者器官分別以單獨(dú)的隔室相連接來模擬多組織器官的作用環(huán)境。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，μCCA裝置能夠捕獲肝臟隔室中的代謝，可以觀察到傳統(tǒng)孔板測定中δ觀察到的腫瘤細(xì)胞的損傷。

結(jié)合PBPK預(yù)測的μCCA裝置可以與人體試驗(yàn)的藥物處理匹配，不僅能模擬動態(tài)的多器官相互作用，并且還能夠模擬現(xiàn)實(shí)的生理微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)體外研究藥物的藥代動力學(xué)等藥效學(xué)性質(zhì)。μCCA裝置的微環(huán)境是基于一個簡化的PBPK數(shù)學(xué)模型設(shè)計的，在研究藥代動力學(xué)、不同器官細(xì)胞間互作及毒性和代謝相互作用的假設(shè)檢驗(yàn)等方面有重要意義。不足的是，當(dāng)細(xì)胞以流體連接的方式培養(yǎng)時，培養(yǎng)基在提供營養(yǎng)物質(zhì)、去除細(xì)胞廢物的同時，也可能會放大δ知灌注液對隔室細(xì)胞的毒性作用。

多通道三維微流控細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(3D-μFCCS)

由于μCCA裝置的不足，要設(shè)計一個體內(nèi)高度保守的系統(tǒng)，重要的是以流體聯(lián)系的方式培養(yǎng)多種細(xì)胞類型，同時保持彼此間的隔離，據(jù)此開發(fā)了一種多通道3D微流控細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(3D microfluidic Cell Culture System, 3D-μFCCS)。

3D-μFCCS是由多個微通道相互連接的微流體通道和微陣列組成，采用微陣列技術(shù)對多種細(xì)胞類型進(jìn)行高密度物理固定，以獲得最大的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。在3D球形微組織和微流控技術(shù)進(jìn)行多組織實(shí)驗(yàn)分析中，將預(yù)先形成的球形微組織裝載到微室中并在連續(xù)灌注下培養(yǎng)，通過自動化的芯片傾斜由重力驅(qū)動的流動產(chǎn)生，而不需要額外的管道和外部泵。以3D-μFCCS為基礎(chǔ)構(gòu)建的鼠肝和大腸腫瘤MOC系統(tǒng)在前體藥物環(huán)磷酰胺存在下培養(yǎng)8d，僅在芯片上不同微量組織類型的共培養(yǎng)物中觀察到對腫瘤生長有顯著影響，而環(huán)磷酰胺處理的靜態(tài)肝臟微組織的不連續(xù)轉(zhuǎn)移上清液并不顯著影響腫瘤生長。該系統(tǒng)驗(yàn)證了環(huán)磷酰胺對腫瘤生長有顯著的影響，但在體外無抗腫瘤活性，只有在肝臟被生物活化之后才起作用。

此外，多通道3D-μFCCS還被設(shè)計用于同時培養(yǎng)不同器官的細(xì)胞聚集體以模擬身體中的多個器官。培養(yǎng)4種不同的細(xì)胞類型，以模擬人類的4種器官：C3A(肝臟)，A549(肺臟)，HK-2(腎臟)和 HPA(脂肪)，通過補(bǔ)充常見的培養(yǎng)基與生長因子來優(yōu)化細(xì)胞功能。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，特異性地將TGF-β1在A549室內(nèi)控制釋放，能增強(qiáng)A549細(xì)胞的功能，而C3A、HK-2和HPA細(xì)胞的功能不受影響，與模擬單個組織功能有所不同。3D-μFCCS裝置上，細(xì)胞培養(yǎng)隔室之間有限的相互作用類似于體內(nèi)的情況。

單向流動的生物測定系統(tǒng)及其他MOC系統(tǒng)

相比μCCA和3D-μFCCS，Imura及其同事構(gòu)建的生物測定系統(tǒng)是相對先進(jìn)的版本，它將人類的腸道，肝臟和乳腺癌細(xì)胞系培養(yǎng)物組合成一個單一的線性通道，應(yīng)用單向流動而不需要介質(zhì)再循環(huán)。微芯片由載玻片，透氣膜和聚二甲基硅氧烷片組成，其中含有通過光刻制成的微通道。將Caco-2克¡結(jié)腸腺癌細(xì)胞在微芯片的膜上培養(yǎng)，模擬藥物的體內(nèi)腸轉(zhuǎn)運(yùn)：環(huán)磷酰胺能透過腸屏障的，表現(xiàn)出較高的滲透系數(shù)，環(huán)磷酰胺不能被腸壁吸收的，表現(xiàn)出較低的滲透系數(shù)。滲透測試結(jié)果與使用傳統(tǒng)方法獲得的結(jié)果一致，而電池消耗減少80%。

近年來，在原有器官芯片系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，MOC系統(tǒng)進(jìn)一步發(fā)展完善。Loskill等利用μOrgano系統(tǒng)研究多個心臟單元，可以單獨(dú)加載不同類型的細(xì)胞，控制分化和發(fā)育的時間，控制各個組織的流體連接，即插即用。Maschmeyer等設(shè)計了可容納兩個微生物流體流動回·的MOC裝置，首次實(shí)現(xiàn)了腸、肝、皮膚和腎4個器官組織在微流控芯片上重復(fù)培養(yǎng)28d，且所有組織在整個共培養(yǎng)期間保持高細(xì)胞活力和離散的生理組織結(jié)構(gòu)，成功從生理角度證明了腸道的功能以及腎臟的生物屏障。除了腸屏障與腎屏障，多器官微流控芯片還成功地模擬了人體的多個生物屏障，例如利用Transwell裝置在懸浮于孔中的濾膜上培養(yǎng)細(xì)胞模擬血腦屏障進(jìn)行藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究及檢測特定標(biāo)志物的表達(dá)，在氣液界面實(shí)現(xiàn)肺上皮細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)的氣血屏障等。

多器官微流控芯片的設(shè)計及新應(yīng)用

多器官微流控芯片設(shè)計

多器官微流控芯片的設(shè)計基于PBPK的理念，可利用模型預(yù)測人體對藥物的反應(yīng)以及藥物的作用機(jī)制。最常制造的裝置是尺寸在10~200mm之間的微流體通道，隔室的大小根據(jù)其功能正確地設(shè)計比例，不同的器官功能根據(jù)其機(jī)制的不同而具有不同的尺度。微流體系統(tǒng)材料通常采用聚二甲基硅氧烷，優(yōu)化后多用多孔性較好的水凝膠，可允許水凝膠支架內(nèi)的分子擴(kuò)散。芯片制作后需要鑒定和測量培養(yǎng)的組織在用藥物或工程刺激物處理時的功能反應(yīng)，進(jìn)行細(xì)胞活力、機(jī)械力、電信號檢測以及化學(xué)分析等。

目前，設(shè)計微流控芯片體系主要使用PBPK模型和PD模型。在PBPK模型中，藥代動力學(xué) (Pharmacokinetics, PK)建模的方法用來設(shè)計和操作以再現(xiàn)多器官相互作用。PK建?？闪炕眢w不同部λ的藥物量，可用簡單的術(shù)語來描述藥物給藥后吸收、分布、代謝和消除的復(fù)雜過程，并深入了解藥物分布動力學(xué)。然而，建立一個生理學(xué)上準(zhǔn)確的模型是十分困難的，因此限制了PK建模的廣泛使用。藥效動力學(xué)(Pharmacodynamics, PD)建模中藥理學(xué)作用被視為藥物濃度的函數(shù)，是針對藥物在體內(nèi)的藥理作用的研究模型。單獨(dú)的PK模型不能闡明時間-藥效的關(guān)系，單獨(dú)的PD模型也不能闡明時間-濃度的關(guān)系，因此需要結(jié)合兩者建立PK-PD模型以研究藥物作用靶部λ的濃度-效應(yīng)-時間三維關(guān)系。在PBPK-PD模型中，PD模型與PK 模型耦合，使用組合的PK-PD模型來預(yù)測或分析給定劑量藥物的生理效應(yīng)，綜合PK-PD模型可以評估特定劑量下藥物的生理結(jié)果的時間依賴性變化，應(yīng)用性相對較廣泛。

多器官微流控芯片的新應(yīng)用

隨著多器官微流控芯片在藥物代謝方面應(yīng)用研究的深入，也產(chǎn)生了各種新應(yīng)用，如利用肺器官芯片研究納米材料毒性及代謝。哈佛大學(xué)通過研究肺對熒光納米顆粒傳遞至肺上皮細(xì)胞引發(fā)的一系列毒性反應(yīng)，來探究應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)的肺芯片系統(tǒng)的潛在價值，為環(huán)境污染物的體內(nèi)代謝模擬研究開拓了新的視野。

與大氣污染物有關(guān)的癌癥病例中，細(xì)顆粒物PM2.5起至關(guān)重要的作用，PM2.5可以穿透人體肺屏障并進(jìn)入血液系統(tǒng)引發(fā)各種疾病甚至癌癥。但其在體內(nèi)的代謝途徑和致癌作用機(jī)理尚不明確。而目前研發(fā)的應(yīng)用于藥代動力學(xué)和藥效學(xué)方面的多器官微流控芯片系統(tǒng)為該類研究提供了新的技術(shù)上的可能。為研究大氣污染與疾病發(fā)生，目前研發(fā)的肺上芯片系統(tǒng)已經(jīng)能夠測試空氣中的微粒和物質(zhì)對單層細(xì)胞或三維細(xì)胞聚集體的毒性。基于微流控技術(shù)評估空氣質(zhì)量對人類健康的影響，利用器官芯片模擬健康和病態(tài)肺的功能，對空氣傳播的污染物暴¶對呼吸系統(tǒng)的短期和長期影響進(jìn)行無動物測試。與口服藥的代謝途徑不同，顆粒物在體內(nèi)的代謝途徑主要有兩種：一是經(jīng)皮膚入血，經(jīng)由心入肺再進(jìn)入體循環(huán)分配到肝和腎;二是經(jīng)肺泡入血進(jìn)入體循環(huán)分配到肝和腎。而δ知濃度的真實(shí)大氣顆粒物樣品進(jìn)入體內(nèi)的分布和代謝由于難以監(jiān)測，無法確定其濃度，因此缺乏相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型來進(jìn)行后續(xù)的研究和預(yù)測，目前多是采用熒光標(biāo)記的人造顆粒物來進(jìn)行模擬。因此在肺芯片相關(guān)毒性研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計合理的真實(shí)反應(yīng)顆粒物體內(nèi)代謝的多器官微流控芯片系統(tǒng)，建立完整的模擬顆粒物代謝的體外平臺、精準(zhǔn)確定顆粒物代謝途徑、制定精確的代謝模型并進(jìn)一步揭示顆粒物的致癌機(jī)理是亟待進(jìn)一步深入研究的重要科學(xué)問題。

此外，微芯片制造通過微電子機(jī)械系統(tǒng)(Microelectromechanical systems, MSMS)與芯片實(shí)驗(yàn)室和器官微流控芯片系統(tǒng)相結(jié)合，MEMS允許將幾種微小或納米微傳感器、致動器、加速度計、熱控制器、微流體推進(jìn)器、微波設(shè)備、衛(wèi)星通信等的各種組件最小化，可用于衛(wèi)星等航天技術(shù)，也可用于監(jiān)測沙塵暴或火山活動等產(chǎn)生的污染源。

展望

微流控技術(shù)由微加工技術(shù)與三維培養(yǎng)相結(jié)合產(chǎn)生，在體外細(xì)胞培養(yǎng)中潛力較高。多器官微流控芯片技術(shù)可在微尺度對流體精準(zhǔn)控制，模擬人體生理環(huán)境，克服了傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)模式與動物實(shí)驗(yàn)的不足，具有高度仿生性。MOC系統(tǒng)的發(fā)展結(jié)合了工程技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，可調(diào)整流體流動和微通道中可控的局部組織-流體比率。MOC技術(shù)旨在建立人工的仿生環(huán)境，在器官-組織水平上模擬，以研究不同器官細(xì)胞之間的相互作用、相關(guān)生理代謝途徑以及生理毒性檢測等。

人體芯片(Human-on-a-chip)是一種利用微加工技術(shù)，基于MOC系統(tǒng)將多個器官微流控芯片連用反映人體整體系統(tǒng)的仿真體系。自2011年NIH、FDA和國防部人體芯片專項設(shè)立以來，全世界范Χ內(nèi)掀起了人體芯片的研究熱潮。Human-on-a-chip旨在通過動態(tài)控制細(xì)胞微環(huán)境的各種培養(yǎng)條件，在微流控芯片上模擬人類多個器官主要功能，從而達(dá)到復(fù)原芯片上的“人體”系統(tǒng)。相較于單器官芯片，人體芯片更能全面反映機(jī)體器官功能的復(fù)雜性、功能變化和完整性，并且應(yīng)用性更強(qiáng)。

目前，基于MOC系統(tǒng)的發(fā)展和完善，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了體外模擬心臟、生物血管、肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、 腸道功能和腎臟生物屏障等環(huán)境。雖然MOC克服了傳統(tǒng)二維細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)的諸多不足，但是也面臨芯片設(shè)計上器官的縮放、高通量分析、芯片上的檢測分析、疾病模型和細(xì)胞來源等問題，在實(shí)驗(yàn)中涉及到的長期的動態(tài)營養(yǎng)平衡、器官的細(xì)胞和組織穩(wěn)態(tài)、毒性檢測的完整性、檢測方法的特異性和靈敏度、芯片的材料等依舊是MOC系統(tǒng)亟待解決和完善的。此外，MOC在生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)、毒性測試、藥物代謝等領(lǐng)域應(yīng)用比較多，但在進(jìn)入體內(nèi)的污染物比如顆粒物PM2.5對人體的毒害及體內(nèi)代謝方面研究極少。相信隨著技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，MOC系統(tǒng)將廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域，我們離‘Human-on-a-chip’的實(shí)現(xiàn)亦越來越近。