Nat Commun：利用CRISPR-Cas9繪制DNA突變

在一項新的研究中，來自美國弗吉尼亞聯(lián)邦大學的Jason Reed博士和同事們開發(fā)出一種新的納米繪圖(nanomapping)技術，這可能引發(fā)致病性基因突變診斷和發(fā)現(xiàn)方法變革。這種新技術將高速原子力顯微鏡(AFM)與一種基于CRISPR的化學條形碼技術結合起來，幾乎與DNA測序那樣準確地繪制DNA圖譜，同時更快地處理大片段的基因組。更重要的是，這種技術能夠由在普通的DNA播放器中發(fā)現(xiàn)的部件供電。相關研究結果于2017年11月21日在線發(fā)表在Nature Communications期刊上，論文標題為“DNA nanomapping using CRISPR-Cas9 as a programmable nanoparticle”。

人類基因組由數(shù)十億個DNA堿基對組成。一旦松散開來，它長將近6英尺。當細胞發(fā)生分裂時，它們必須為新的細胞拷貝它們的DNA。然而，有時這種DNA的多種片段被錯誤地拷貝或者在錯誤的位點連接在一起，從而產(chǎn)生導致癌癥等疾病的基因突變。DNA測序是如精確以至于它能夠分析DNA的單個堿基對。但是為了分析大片段的基因組來發(fā)現(xiàn)基因突變，技術人員必須確定數(shù)百萬個微小的序列，然后利用計算機軟件將它們拼接在一起。相反之下，諸如熒光原位雜交(FISH)之類的生物醫(yī)學成像技術僅能夠在幾萬個堿基對的分辨率下分析DNA。

Reed的這種新的高速AFM方法能夠在數(shù)十個堿基對的分辨率下繪制DNA圖譜，同時創(chuàng)建分辨率高達一百萬個堿基對的圖片。而且它使用的樣品數(shù)量僅是DNA測序所需的一小部分。

Reed說，“DNA測序是一種強大的工具，但是它仍然具有高昂的成本，并有一些技術和功能上的局限性，從而使得難以高效地和準確地繪制出大片段的基因組。我們的方法填補了DNA測序和其他的分辨率較低的物理圖譜技術之間的差距。它能夠作為一種獨立的方法加以使用，也能夠作為DNA測序的補充，降低在DNA測序過程中將小片段的基因組拼接在一起時的復雜性和錯誤。”

AFM通過它的微針(microscopic stylus)與被研究的材料的表面相接觸來繪制出這種材料表面的圖片。然而，傳統(tǒng)的AFM對醫(yī)學應用來說太慢了，因此，它主要由材料科學的工程師使用。

Reed說，“我們的設備與AFM的工作方式相同，但是讓樣品以更大的速度經(jīng)過這種微針，并且利用光學儀器檢測這種微針與材料表面上的分子之間的相互作用。我們能夠達到與傳統(tǒng)的AFM一樣的觀察細節(jié)，但是能夠比后者快一千倍地處理材料。高速AFM非常適合于一些醫(yī)學應用，這是因為它能夠快速地處理材料，并且提供比同類的成像方法高上百倍的分辨率。”

提高AFM的速度僅是Reed和他的同事們必須克服的一個障礙。為了真正地鑒定出DNA中的基因突變，他們必須開發(fā)出一種將標志物或標簽放置在DNA分子表面上的方法，這樣他們就能夠識別出這些分子中的模式和不規(guī)則性。他們還利用CRISPR技術開發(fā)出一種巧妙的化學條形碼方法。

最近因在基因編輯方面取得的進展，CRISPR/Cas9系統(tǒng)成為了很多新聞報道的頭條?？茖W家們利用向?qū)NA對酶Cas9進行“編程”，從而在準確的位點上切割DNA，隨后細胞能夠自我修復這種DNA損傷。Reed團隊改變這種酶的化學反應條件以至于它僅結合到DNA上，但并不切割它。

Reed說，“鑒于Cas9是一種在物理上比DNA分子更大的蛋白，它對這種條形碼應用來說是非常完美的。我們驚訝地發(fā)現(xiàn)它結合到DNA分子上的效率接近90%。而且因為觀察Cas9是比較容易的，所以你能夠在DNA的模式中發(fā)現(xiàn)基因突變。”

為了證實這種技術的有效性，這些研究人員繪制出淋巴瘤患者的淋巴結活組織樣品中存在的基因易位。這些基因易位在淋巴瘤等血癌中特別普遍，但是也存在于其他的癌癥中。

盡管這種技術具有很多潛在的用途，但是Reed和他的團隊正在專注于醫(yī)學應用。他們當前正在基于現(xiàn)存的算法開發(fā)軟件以便能夠分析長一百萬個堿基對及以上的DNA片段中的模式。一旦開發(fā)完成，就不難想象在病理實驗室中，這種鞋盒大小的儀器就有助診斷和治療與基因突變相關的疾病。