分光光度計(jì)如何定量核酸?分光光度計(jì)有何使用注意事項(xiàng)?

分光光度計(jì)具有重要應(yīng)用，不管是在工業(yè)環(huán)境還是實(shí)驗(yàn)室中，都有分光光度計(jì)的身影。為增進(jìn)大家對(duì)分光光度計(jì)的認(rèn)識(shí)，本文將對(duì)分光光度計(jì)的應(yīng)用以及分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)予以介紹。如果你對(duì)分光光度計(jì)具有興趣，不妨繼續(xù)往下閱讀哦。

一、分光光度計(jì)用于核酸定量

核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如：1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

事實(shí)上，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測(cè)試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。

除了核酸濃度，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評(píng)估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

二、分光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)

1)為了防止光電管疲勞：不測(cè)定時(shí)必須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長(zhǎng)光電管使用壽命。

2)比色皿的使用方法：

①拿比色皿時(shí)：手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。

②清洗比色皿時(shí)：一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。如，比色皿被有機(jī)物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液(1:2)浸泡片刻，再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強(qiáng)的洗滌液洗比色皿，以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透光面。每次做完實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)立即洗凈比色皿。

③比色皿外壁的水用擦鏡紙或細(xì)軟的吸水紙吸干：以保護(hù)透光面。

④測(cè)定有色溶液吸光度時(shí)：一定要用有色溶液洗比色皿內(nèi)壁幾次，以免改變有色溶液的濃度。另外，在測(cè)定一系列溶液的吸光度時(shí)，通常都按由稀到濃的順序測(cè)定，以減小測(cè)量誤差。

⑤在實(shí)際分析工作中：通常根據(jù)溶液濃度的不同，選用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。分光光度計(jì)的維護(hù)和保養(yǎng)分光光度計(jì)是精密儀器，正確安裝、使用和保養(yǎng)對(duì)保持儀器良好的性能和保證測(cè)試的準(zhǔn)確度有重要作用。

1.對(duì)儀器工作環(huán)境的要求分光光度計(jì)應(yīng)安裝在穩(wěn)定的工作臺(tái)上，(周圍不應(yīng)有強(qiáng)磁場(chǎng), 以防電磁干擾)，室內(nèi)溫度應(yīng)保持在(10～30)℃。室內(nèi)應(yīng)干燥，相對(duì)濕度宜控制在<85 %，室內(nèi)應(yīng)無腐蝕性氣體，光線不宜過強(qiáng)。

2.儀器保養(yǎng)和維護(hù)方法

(1)儀器工作電壓一般為220V，允許±10 %的電壓波動(dòng)。為保持光源燈和檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，在電源電壓波動(dòng)較大的實(shí)驗(yàn)室最好配備穩(wěn)壓器。

(2)為了延長(zhǎng)光源使用壽命，在不用時(shí)不用開光源燈。如果光源燈亮度明顯減弱或不穩(wěn)定，應(yīng)及時(shí)更換新燈。更換后要調(diào)節(jié)好燈絲位置，不要用手直接接觸窗口或燈泡，避免油污沾附，若不小心接觸過，要用無水乙醇擦拭。

(3)單色器是儀器的核心部分，裝在密封盒內(nèi)，不能拆開，為防止色散元件受潮發(fā)霉，必須經(jīng)常更換干燥劑。

(4)必須正確使用吸收池，保護(hù)吸收池光學(xué)面。

(5)光電轉(zhuǎn)換元件不能長(zhǎng)時(shí)間曝光，應(yīng)避免強(qiáng)光照射或受潮積塵。

以上便是此次小編帶來的分光光度計(jì)相關(guān)內(nèi)容，通過本文，希望大家對(duì)分光光度計(jì)具備一定的了解。如果你喜歡本文，不妨持續(xù)關(guān)注我們網(wǎng)站哦，小編將于后期帶來更多精彩內(nèi)容。最后，十分感謝大家的閱讀，have a nice day!