激光共聚焦顯微鏡原理是什么?激光共聚焦顯微鏡有哪些功能?

激光共聚焦顯微鏡屬于納米級測量儀器，因此在納米觀測領(lǐng)域常用激光共聚焦顯微鏡。為增進(jìn)大家對激光共聚焦顯微鏡的認(rèn)識(shí)，本文將對激光共聚焦顯微鏡原理以及激光共聚焦顯微鏡的功能予以介紹。如果你對激光共聚焦顯微鏡具有興趣，不妨繼續(xù)往下閱讀哦。

一、激光共聚焦顯微鏡原理

在普通寬視野光學(xué)顯微鏡中，整個(gè)標(biāo)本全部都被水銀弧光燈或氙燈的光線照明，圖像可以用肉眼直接觀察。 同時(shí)，來自焦點(diǎn)以外的其他區(qū)域的熒光對結(jié)構(gòu)的干擾較大，尤其是標(biāo)本的厚度在 2um 以上時(shí)，其影響更為明顯。

激光共聚焦顯微鏡脫離了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的場光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束經(jīng)照明針孔，經(jīng)由分光鏡反射至物鏡，并聚焦于樣品上，對標(biāo)本焦平面上每一點(diǎn)進(jìn)行掃描。 組織樣品中如果有可被激發(fā)的熒光物質(zhì)，受到激發(fā)后發(fā)出的熒光經(jīng)原來入射光路直接反向回到分光鏡，通過探測針孔時(shí)先聚焦，聚焦后的光被光電倍增管(PMT)探測收集，并將信號輸送到計(jì)算機(jī)，處理后在計(jì)算機(jī)顯示器上顯示圖像。 在這個(gè)光路中，只有在焦平面的光才能穿過探測針孔，焦平面以外區(qū)域射來的光線在探測小孔平面是離焦的，不能通過小孔。因此，非觀察點(diǎn)的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔與探測針孔，焦平面以外的點(diǎn)不會(huì)在探測針孔處成像，即共聚焦。 以激光作光源并對樣品進(jìn)行掃描，在此過程中兩次聚焦，故稱為激光掃描共聚焦顯微鏡。

二、激光共聚焦顯微鏡功能

1、組織和細(xì)胞中的定量熒光測定

激光掃描共聚焦顯微鏡可以從固定和熒光染色的標(biāo)本以單波長、雙波長或多波長模式，對單標(biāo)記或多標(biāo)記的細(xì)胞及組織標(biāo)本的共聚焦熒光進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和定量分析,同時(shí)還可以利用沿縱軸上移動(dòng)標(biāo)本進(jìn)行多個(gè)光學(xué)切片的疊加， 形成組織或細(xì)胞中熒光標(biāo)記結(jié)構(gòu)的總體圖像,以顯示熒光在形態(tài)結(jié)構(gòu)上的精確定位。 常用于原位分子雜交、腫瘤細(xì)胞凋亡觀察、單個(gè)活細(xì)胞水平的 DNA 損傷及修復(fù)等定量分析。

2、細(xì)胞間通訊的研究

動(dòng)物和植物細(xì)胞中縫隙連接介導(dǎo)的胞間通信在細(xì)胞增殖和分化中起著重要作用。 激光掃描共聚焦顯微鏡可通過觀察細(xì)胞縫隙連接分子的轉(zhuǎn)移來測量傳遞細(xì)胞調(diào)控信息的一些離子、小分子物質(zhì)。 該技術(shù)可以用于研究胚胎發(fā)生、生殖發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)、腫瘤發(fā)生等過程中縫隙連接通訊的基本機(jī)制和作用，也可用于鑒別對縫隙連接作用有潛在毒性的化學(xué)物質(zhì)。

3、細(xì)胞物理化學(xué)測定

激光掃描共聚焦顯微鏡可對細(xì)胞形狀、周長、面積、平均熒光強(qiáng)度及細(xì)胞內(nèi)顆粒數(shù)等參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)測定。 能對細(xì)胞的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞內(nèi)特異結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進(jìn)行定量、定性、定時(shí)及定位測定。

4、細(xì)胞內(nèi)鈣離子和 pH 值動(dòng)態(tài)分析

激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)是測量若干種離子濃度并顯示其分布的有效工具，對焦點(diǎn)信息的有效辨別使在亞細(xì)胞水平顯示離子分布成為可能。 利用熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可以測量單個(gè)細(xì)胞內(nèi) pH 和多種離子(Ca2+、K+、Na+、Mg2+)在活細(xì)胞內(nèi)的濃度及變化。 一般來說，電生理記錄裝置加攝像技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)離子量變化的速度相對較快,但其圖像本身的價(jià)值較低,而激光掃描共聚焦顯微鏡可以提供更好的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中鈣離子濃度動(dòng)態(tài)變化的圖像,這對于研究鈣等離子細(xì)胞內(nèi)動(dòng)力學(xué)有意義。

5、三維圖像的重建

傳統(tǒng)的顯微鏡只能形成二維圖像，激光掃描共聚焦顯微鏡通過對同一樣品不同層面的實(shí)時(shí)掃描成像，進(jìn)行圖像疊加可構(gòu)成樣品的三維結(jié)構(gòu)圖像。 它的優(yōu)點(diǎn)是可以對樣品的立體結(jié)構(gòu)分析，能十分靈活、直觀地進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。

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