2019諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)背后的科學(xué)：細(xì)胞如何感知氧氣

10月7日晚間消息，2019年度的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)已經(jīng)宣布，今年的獎(jiǎng)項(xiàng)授予兩位美國(guó)科學(xué)家和一位英國(guó)科學(xué)家：授予威廉·凱林（William G。 Kaelin），彼得·拉特克利夫爵士（Sir Peter J。 Ratcliffe）以及格雷格·薩門扎（Gregg L。 Semenza），以表彰他們?cè)凇吧镌诜肿訉用嫔先绾胃兄鯕狻狈矫嫠鞒龅拈_創(chuàng)性貢獻(xiàn)。

細(xì)胞是如何感知氧氣的？

自從現(xiàn)代生物學(xué)的伊始，人們就知道生命的維持需要氧氣，但是生物細(xì)胞是如何做出調(diào)整以適應(yīng)不同的氧氣供應(yīng)環(huán)境的？其背后的分子機(jī)制究竟是什么？這兩個(gè)問(wèn)題卻一直未能被很好的理解，直到今年的幾位諾貝爾獎(jiǎng)獲獎(jiǎng)人所做的工作闡明了這一機(jī)制。

當(dāng)周圍的氧氣水平發(fā)生變化時(shí)，動(dòng)物細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷基因表達(dá)上的明顯改變。這種基因表達(dá)上的改變會(huì)同時(shí)改變細(xì)胞新陳代謝，組織重塑，甚至組織反應(yīng)，比如心率加速，或者呼吸量的改變。

在1990年代早期的研究中，格雷格·薩門扎最早識(shí)別，并于此后在1995年最終提純并克隆了一種轉(zhuǎn)錄因子，其對(duì)這些與氧氣密切相關(guān)的反應(yīng)機(jī)制起到調(diào)節(jié)作用。他將這一因子命名為HIF，即“缺氧誘導(dǎo)因子”，并確認(rèn)其包含兩個(gè)部分：一種是全新發(fā)現(xiàn)的，對(duì)氧氣敏感的HIF-1a，另一種是此前就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的，固有性表達(dá)，并且并不受氧氣調(diào)節(jié)的蛋白質(zhì)“ARNT”。1995年，威廉·凱林正在從事馮·希佩爾-林道腫瘤抑制基因的研究并成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)該基因的全序列分離與克隆，他發(fā)現(xiàn)，這種基因可以抑制VHL突變致癌細(xì)胞系中的腫瘤生長(zhǎng)。

隨后，在1999年，彼得·拉特克利夫證明了，VHL 與HIF1a之間存在某種關(guān)聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)VHL可以調(diào)節(jié)HIF-1a的翻譯后及氧敏降解。最后，凱林和拉特克利夫的研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)證明了這種VHL對(duì)于HIF-1a的調(diào)節(jié)機(jī)制會(huì)受到HIF-1a羥基化的影響，這是一種共價(jià)修飾，其本身將受到氧氣水平高低的影響。

由于以上這三位獲獎(jiǎng)人的工作，證明了由于氧氣水平改變引發(fā)的基因表達(dá)反應(yīng)，與動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的氧氣水平之間存在直接耦合關(guān)系，從而允許透過(guò)HIF轉(zhuǎn)錄因子的作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)于氧化反應(yīng)的快速細(xì)胞層面響應(yīng)。

氧氣與動(dòng)物生命

在1770年代，瑞典科學(xué)家卡爾·舍勒（Carl Scheele）通過(guò)計(jì)算得到結(jié)論，空氣中大約有1/4的體積是所謂的“feuer luft”，即他所稱的“火氣”，也就是可以支持物體發(fā)生燃燒的氣體。這一發(fā)現(xiàn)的相關(guān)論文最終于1777年公開發(fā)表（Scheele，1777）。大約與此同時(shí)，在英國(guó)，約瑟夫·普里斯特利（Joseph Priestley）也發(fā)現(xiàn)了一種方法來(lái)提純這種此前未知的氣體，并將其稱之為“去燃素空氣”（Priestley， 1775）。而除了舍勒和普里斯特利之外，大致同一時(shí)間，法國(guó)化學(xué)家安托萬(wàn)·拉瓦錫（Antoine Lavoisier）也在巴黎進(jìn)行了對(duì)這種氣體的分離試驗(yàn)，并且也對(duì)其進(jìn)行了自己的命名。而這個(gè)命名也正是這種氣體在今天被廣為接受的名稱：氧氣 （Lavoisier， 1777）。

動(dòng)物生命離不開氧氣，因?yàn)槲覀兊纳眢w需要借助氧化反應(yīng)驅(qū)動(dòng)將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為ATP。事實(shí)上，根據(jù)可獲得的氧氣數(shù)量來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)，正是新陳代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵內(nèi)容之一。早在一個(gè)多世紀(jì)之前我們就已經(jīng)明白這個(gè)道理，比如在1858年，法國(guó)微生物學(xué)家路易斯·巴斯德（Louis Pasteur）最先證明在動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)存在復(fù)雜的氧氣使用平衡，并證明細(xì)胞會(huì)透過(guò)多條復(fù)雜路徑來(lái)完成能量轉(zhuǎn)換（Pasteur， 1858）。

而關(guān)于動(dòng)物體內(nèi)對(duì)氧氣的感知機(jī)制，此前已經(jīng)獲得過(guò)兩次諾貝爾獎(jiǎng)，一次是1931年授予德國(guó)生理學(xué)家?jiàn)W拓·沃伯格（Otto Warburg），其成就是發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞呼吸的酶基礎(chǔ)，第二次是1938年授予比利時(shí)醫(yī)學(xué)家柯奈爾?海門斯（Corneille Heymans），獎(jiǎng)勵(lì)其在神經(jīng)系統(tǒng)在機(jī)體對(duì)氧氣的呼吸反應(yīng)中所發(fā)揮的作用方面進(jìn)行的研究。然而，在整個(gè)20世紀(jì)的大部分時(shí)間里，我們?nèi)匀徊磺宄?，?duì)于氧氣水平變化的調(diào)節(jié)機(jī)制，是如何在基因表達(dá)的基礎(chǔ)水平上得到調(diào)節(jié)的。

對(duì)不同氧氣水平的適應(yīng)

對(duì)于絕大部分動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞而言，能夠?qū)ρ鯕馑降淖兓龀隹焖傧鄳?yīng)是非常關(guān)鍵的。分子分類學(xué)已經(jīng)清楚表明，在生物演化過(guò)程中，隨著動(dòng)物細(xì)胞開始聚集到一起，組成多細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)體生命開始，這種對(duì)于氧氣水平的響應(yīng)能力便不再僅僅是一種細(xì)胞層面的，用作調(diào)節(jié)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部新陳代謝水平的反應(yīng)，而且還發(fā)展出了一套復(fù)雜的生理反應(yīng)機(jī)制。細(xì)胞需要作出許多自動(dòng)反應(yīng)，以對(duì)變化的氧氣供應(yīng)水平作出反應(yīng)，其中尤為重要的是對(duì)自身的新陳代謝水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。

當(dāng)在組織和器官層面觀察這種反應(yīng)時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)多細(xì)胞組織不僅需要重塑自身組織以適應(yīng)變化后的氧氣環(huán)境（比如在受傷之后重構(gòu)血管系統(tǒng)），還需要調(diào)動(dòng)整個(gè)組織以補(bǔ)償氧化水平的變化（比如劇烈運(yùn)動(dòng)后，或者暴露于高海拔地區(qū)時(shí)，人的呼吸會(huì)變得急促）。

作為一個(gè)案例：生活在高海拔地區(qū)的人們，其體內(nèi)的氧氣水平變化是由其腎臟內(nèi)的一種特殊細(xì)胞負(fù)責(zé)感知的，其可以分泌并釋放一類名為“紅細(xì)胞生成素”（EPO）的荷爾蒙。這種荷爾蒙會(huì)激活骨髓中的血紅細(xì)胞合成。促發(fā)這一反應(yīng)的一種方式是暴露于高海拔地區(qū)的低氧環(huán)境下，在這樣的環(huán)境中，腎臟的EPO生成速度將加速，從而導(dǎo)致血液內(nèi)紅細(xì)胞含量升高，從而幫助我們的身體更好適應(yīng)高海拔地區(qū)的低氧環(huán)境。

動(dòng)物可以暴露于低氧環(huán)境，但有一點(diǎn)很重要，氧氣水平在身體組織內(nèi)部也會(huì)出現(xiàn)起伏波動(dòng)。動(dòng)物機(jī)體組織內(nèi)部的氧氣水平會(huì)出現(xiàn)空間和時(shí)間上的變化，而這種變化在正常生理事件中也會(huì)頻繁發(fā)生，比如運(yùn)動(dòng)過(guò)后骨骼肌的缺氧，但也會(huì)在病理過(guò)程中出現(xiàn)，比如癌癥和感染。而通過(guò)上世紀(jì)1970~1980年代期間的相關(guān)工作，事情逐漸變得明朗：這些局部和暫時(shí)性的氧氣水平改變會(huì)通過(guò)基因表達(dá)的形式，激發(fā)細(xì)胞和組織層面的關(guān)鍵性適應(yīng)反應(yīng)。

這些基因調(diào)節(jié)反應(yīng)將會(huì)改變細(xì)胞新陳代謝，并控制基礎(chǔ)性發(fā)育，再生和機(jī)體防御機(jī)制，包括血管形成，發(fā)炎等。

動(dòng)物細(xì)胞感知不同氧氣水平的能力，以及隨之改變自身基因表達(dá)的機(jī)制，對(duì)于機(jī)體的生存至關(guān)重要。這種氧氣驅(qū)動(dòng)的信號(hào)通路至少影響著300個(gè)不同的基因，它們分屬于多個(gè)不同的機(jī)體調(diào)節(jié)系統(tǒng)。

這些分子水平上的通路廣泛參與多種生理過(guò)程，從器官發(fā)育到代謝平衡再到組織再生和免疫功能，并在許多疾病的進(jìn)展中起到關(guān)鍵性作用，其中包括癌癥。

氧氣與紅細(xì)胞生成

生物體內(nèi)的任何關(guān)鍵性信號(hào)通路，幾乎肯定會(huì)與不同層面上的大量其他分子通路之間存在相互關(guān)聯(lián)。氧氣響應(yīng)通路也不例外。因此，正如預(yù)料的那樣，今年獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的這些基礎(chǔ)性工作，并未終結(jié)在分子層面氧氣響應(yīng)機(jī)制方面的研究，與此相反，這些關(guān)鍵性發(fā)現(xiàn)開啟了一個(gè)嶄新領(lǐng)域，激發(fā)大量研究人員投入其中，取得大量研究成果，揭示出分子層面對(duì)氧氣響應(yīng)機(jī)制的極度復(fù)雜性。

今年的三位獲獎(jiǎng)人：威廉·凱林，彼得·拉特克利夫以及格雷格·薩門扎所取得的基礎(chǔ)性發(fā)現(xiàn)，都是圍繞缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）的作用所展開的。這一因子的發(fā)現(xiàn)，最早需要追溯到在1986年至1987年間多位研究人員所做的工作，其中包括莫里斯·邦杜倫特（Maurice Bondurant），馬克·克里（Mark Koury）以及賈米·卡羅（Jaime Caro）等；他們的工作表明低氧環(huán)境會(huì)促發(fā)腎臟內(nèi)紅細(xì)胞生成素（EPO）荷爾蒙的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（Bondurant and Koury， 1986； Jelkmann and Hellwig-Burgel， 2001；Schuster et al。， 1987）

這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)反過(guò)來(lái)，植根于1882年開展的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，以及法國(guó)生理學(xué)家保羅·博特（Paul Bert）的相關(guān)工作（Bert， 1878），他在1878年最先證明了低氧環(huán)境對(duì)于心血管產(chǎn)生的效應(yīng)，也是首位發(fā)現(xiàn)暴露于高海拔環(huán)境下，會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)紅細(xì)胞數(shù)量增加的科學(xué)家（Bert， 1882）。

HIF的分離

在發(fā)現(xiàn)EPO基因表現(xiàn)出缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之后，下一步就是確定EPO基因調(diào)控區(qū)域中負(fù)責(zé)氧敏感性的DNA序列。薩門扎決定在轉(zhuǎn)基因小鼠身上追蹤EPO基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，他使用的是包含人類EPO基因的不同大小的DNA片段克隆。薩門扎和同事們首先闡明了一個(gè)覆蓋了EPO編碼序列的區(qū)域，包含了4000個(gè)堿基，以及一些小的5 ‘和3 ’側(cè)翼序列，這些序列會(huì)導(dǎo)致所有被分析的轉(zhuǎn)基因組織產(chǎn)生EPO，并導(dǎo)致循環(huán)的EPO水平升高，從而產(chǎn)生紅血球增多癥，即紅細(xì)胞的計(jì)數(shù)增加。接下來(lái)，薩門扎證明了一個(gè)更長(zhǎng)的EPO基因結(jié)構(gòu)，包含6000個(gè)堿基的5’側(cè)翼DNA序列，能夠在腎臟中誘導(dǎo)EPO表達(dá)。這項(xiàng)工作指向了一個(gè)EPO對(duì)氧反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合體，包括正調(diào)控和負(fù)調(diào)控因子。

一年后的1991年，薩門扎在另兩項(xiàng)研究中，增加了調(diào)節(jié)EPO基因的重要信息：1）一項(xiàng)脫氧核糖核酸酶（DNAse）過(guò)敏癥研究發(fā)現(xiàn)，EPO 3 ‘側(cè)翼DNA的一小塊區(qū)域結(jié)合了幾個(gè)核因子，其中至少有兩個(gè)因子是由肝臟和腎臟貧血誘導(dǎo)的；這個(gè)小區(qū)域能夠作為缺氧誘導(dǎo)的增強(qiáng)子，在體外瞬時(shí)表達(dá)測(cè)定中發(fā)揮作用；2）進(jìn)一步研究了EPO在轉(zhuǎn)基因模型中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。大約在同一時(shí)間，彼得·拉特克利夫爵士和賈米·卡羅實(shí)驗(yàn)室報(bào)告稱，EPO基因中存在一個(gè)具有順式作用的DNA 3’元件，在轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞中，該元件賦予了報(bào)告基因?qū)ρ醯捻憫?yīng)性。

上述工作使薩門扎于1992年在EPO基因的3 ‘端發(fā)現(xiàn)了約50個(gè)堿基對(duì)的增強(qiáng)子，可用于誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)型報(bào)告基因在培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)。這種增強(qiáng)子被薩門扎稱為缺氧反應(yīng)元件（HRE），它結(jié)合了肝癌細(xì)胞中的幾個(gè)核因子：一個(gè)是本身結(jié)構(gòu)，另一個(gè)是缺氧誘導(dǎo)的。后者因此被薩門扎稱為低氧誘導(dǎo)因子（HIF）。

拉特克利夫和薩門扎都證明，EPO基因的3’增強(qiáng)子可以在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型中驅(qū)動(dòng)缺氧誘導(dǎo)型報(bào)告基因表達(dá)。這表明，參與EPO基因氧調(diào)節(jié)的分子機(jī)制在多種動(dòng)物細(xì)胞中都很活躍的，HIF因此也很可能是常見(jiàn)的氧感知細(xì)胞機(jī)制的一部分。

低氧誘導(dǎo)HIF可以在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中觀察到，不僅僅是腎臟和肝臟中產(chǎn)生EPO的細(xì)胞。這一觀點(diǎn)引起了更廣泛的科學(xué)家群體的興趣和關(guān)注。HIF的發(fā)現(xiàn)表明了一種潛在的，普遍存在于代謝適應(yīng)基礎(chǔ)上的分子機(jī)制，并在組織氧通量的作用下誘導(dǎo)組織重塑。

此時(shí)，薩門扎采用生化方法從大量的細(xì)胞提取物中純化HIF蛋白質(zhì)。在純化過(guò)程中進(jìn)行功能分析時(shí)，他使用了應(yīng)用于EPO基因3’增強(qiáng)子的電泳遷移率轉(zhuǎn)移（EMSA）實(shí)驗(yàn)。氨基酸測(cè)序和隨后對(duì)純化蛋白質(zhì)的cDNA克隆表明，HIF本身是一個(gè)異源二聚體，由兩個(gè)不同的基因產(chǎn)物組成。第一個(gè)組件是對(duì)氧敏感的部分，稱為HIF-1α；第二個(gè)組件是一種結(jié)構(gòu)性表達(dá)的基因，最初被稱為HIF-1b。后來(lái)，更多的研究對(duì)HIF-1b進(jìn)行了克隆和描述，并稱其為芳香烴受體核轉(zhuǎn)位子（ARNT）。ARNT蛋白和其他一些因子會(huì)形成異二聚物，而且它的表達(dá)并不會(huì)對(duì)氧含量敏感，因此顯而易見(jiàn)，HIF-1α才是復(fù)合體中氧響應(yīng)性的調(diào)節(jié)者。

HIF家族的擴(kuò)大

有四個(gè)研究小組獨(dú)立克隆出了一個(gè)與HIF-1α高度相關(guān)的蛋白質(zhì)，即Yoshiaki Fujii-Kuriyama、Werner Risau、Christopher Bradfield和Steven McKnight的團(tuán)隊(duì)。他們的研究都是在1997年完成的。編碼該蛋白質(zhì)的基因最初有許多名稱，包括仍然很常用的“HIF-2a”。不過(guò)，該基因恰當(dāng)?shù)拿Q是EPAS1。EPAS1基因編碼的蛋白質(zhì)與HIF-1α具有高度的序列同源性，并且也能結(jié)合ARNT異質(zhì)二聚體。它與HIF-1α一樣，都對(duì)缺氧敏感，并且?guī)缀蹙哂泻虷IF-1α同樣的調(diào)節(jié)功能。

然而， HIF-1α和EPAS1之間也存在顯著的功能差異。HIF-1α基因缺失的小鼠出現(xiàn)了一個(gè)明確的表型，即中期妊娠致死性；而Epas1基因缺失則具有高度變化的表型，可能是遺傳背景的變化造成的。此外，有大量證據(jù)表明，某些缺氧反應(yīng)僅由某種對(duì)氧敏感的HIF同等型專一控制，例如，紅細(xì)胞生成似乎就主要由EPAS1控制。

HIF的調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)譯之后，且涉及VHL

由多個(gè)實(shí)驗(yàn)室（包括拉特克利夫所在的實(shí)驗(yàn)室在內(nèi)）收集的數(shù)據(jù)顯示，HIF-1a水平本身受蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的變化調(diào)節(jié)、而非受基因轉(zhuǎn)錄或蛋白質(zhì)合成的變化調(diào)節(jié)。許多團(tuán)隊(duì)隨后進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，HIF-1a會(huì)通過(guò)“泛素-蛋白酶體”通路降解，且該過(guò)程依賴于氧氣。該研究還確定了HIF-1a中負(fù)責(zé)這類降解的特定結(jié)構(gòu)區(qū)域（名為ODD區(qū)域，即“依賴于氧氣的降解”的英文縮寫，在HIF-1a和EPAS1中均存在）。

大約在同一時(shí)期，1995年，凱林的團(tuán)隊(duì)首次發(fā)表了VHL腫瘤抑制基因的完整序列，并指出若向腎細(xì)胞癌細(xì)胞株中重新引入一種野生型VHL，便可阻止該細(xì)胞株形成腫瘤。凱林和其它多支研究團(tuán)隊(duì)一直在研究VHL基因、以及該基因與一系列對(duì)特定癌癥具有遺傳易感性的基因家族的聯(lián)系。凱林發(fā)表的論文中指出，VHL是一種腫瘤抑制基因，其活動(dòng)能夠抑制VHL基因變異的患者體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。1996年，在確定VHL基因特性的過(guò)程中，凱林的團(tuán)隊(duì)與馬克·戈德伯格團(tuán)隊(duì)間的合作研究顯示，VHL變異細(xì)胞株中有許多HIF目標(biāo)基因存在過(guò)度表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，“HIF應(yīng)答”與“VHL相關(guān)腫瘤生長(zhǎng)”兩條通路之間可能存在一定聯(lián)系。

而在尋找能夠與VHL蛋白質(zhì)結(jié)合的物質(zhì)時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)了與VHL功能有關(guān)的一條重要線索。1995年，理查德·克勞斯納與同事們、以及凱林所在的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，VHL會(huì)與轉(zhuǎn)錄延伸因子B和C發(fā)生相互作用。1997年，克勞斯納、W·馬斯頓·萊恩漢和同事們發(fā)現(xiàn)，VHL存在于一種與Cul-2蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合體中，這是蛋白質(zhì)泛化中涉及的一種因子。該研究發(fā)現(xiàn)隨后被凱林成功復(fù)制。由于延伸因子C和Cul-2蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似于Skp1和Cdc53（這兩種因子都會(huì)使特定蛋白質(zhì)在泛素作用下發(fā)生水解），這說(shuō)明VHL與蛋白質(zhì)降解之間或具有某種聯(lián)系。

HIF以泛素化和被VHL水解為目標(biāo)

盡管研究人員在1996至1998年間弄清了HIF-1a和EPAS1在常氧狀態(tài)下、會(huì)通過(guò)蛋白酶體降解被迅速消除，但仍不清楚該過(guò)程在缺氧狀態(tài)下是如何受到抑制的。這里缺失的一塊拼圖便是泛素E3連接酶，研究人員懷疑該物質(zhì)與將HIF-1a確定為降解目標(biāo)有關(guān)。而在這一點(diǎn)上，拉克利夫和同事們?cè)?999年取得了關(guān)鍵性突破：他們?cè)谡撐闹兄赋?，VHL復(fù)合體參與了HIF-1a的水解過(guò)程。他們和其他研究人員隨后提出，VHL在這一過(guò)程中起到了識(shí)別泛素E3連接酶的作用。

此時(shí)，整幅“拼圖”還缺少關(guān)鍵的一塊：VHL與HIF-1a之間的相互作用、以及后續(xù)的HIF-1a降解究竟是如何受氧氣調(diào)節(jié)的？麥克斯維爾等人在1999年發(fā)表的論文中指出，VHL與HIF-1a之間的相互作用既依賴于氧氣、又依賴于鐵。這一發(fā)現(xiàn)促使研究人員展開了對(duì)相關(guān)機(jī)制的搜尋：既要尋找HIF-1a依賴于氧氣發(fā)生的、使之能夠與VHL相結(jié)合的化學(xué)變化，又要尋找能夠催化該反應(yīng)的酶。

此時(shí)研究人員已經(jīng)了解到，膠原蛋白中會(huì)發(fā)生依賴于氧氣的蛋白質(zhì)羥基化，且該反應(yīng)可由膠原脯氨酸-4-羥化酶調(diào)節(jié)。因此研究人員猜測(cè)，HIF-1a中殘余脯氨酸依賴于氧氣發(fā)生的羥基化或許能產(chǎn)生與VHL相結(jié)合所需的構(gòu)象變化。這一猜測(cè)隨后果然得到了證實(shí)。2001年，拉克利夫和凱林所在的實(shí)驗(yàn)室同時(shí)報(bào)告稱，HIF-1a中ODD區(qū)域內(nèi)部的兩種脯氨酸殘余物依賴于氧氣發(fā)生的4-羥基化增強(qiáng)了HIF轉(zhuǎn)錄因子中VHL復(fù)合體結(jié)合的親和性。描述該現(xiàn)象的兩篇論文在2001年以“背靠背”的形式發(fā)表。

氧依賴性的開關(guān)

脯氨酸羥基化需要氧氣，由此科學(xué)家揭示了HIF-1α和EPAS1蛋白質(zhì)的翻譯后調(diào)控機(jī)制：在缺氧的情況下，羥基化不可能發(fā)生，VHL無(wú)法識(shí)別HIF-1α；正因?yàn)槿绱耍琀IF-1α不會(huì)泛素化，從而避免了被蛋白酶體降解，依然完好無(wú)損。HIF-1α逐漸積累，并激活了低氧誘導(dǎo)基因α的程序（圖1）。

拉特克利夫團(tuán)隊(duì)和 McKnight團(tuán)隊(duì)獨(dú)立確定了參與HIF-1α和EPAS1羥基化的脯氨酸羥化酶（PHD）基因。他們的論文描述了PHD基因的分離，都發(fā)表于2001年。凱林的團(tuán)隊(duì)還用生化方法分離了PHD基因，并在2002年發(fā)表了這項(xiàng)研究。這些羥化酶的發(fā)現(xiàn)為制造特殊的PHD抑制劑，進(jìn)而提高HIF活性提供了可能。例如，我們或許可以通過(guò)這種方法增加貧血患者的紅細(xì)胞生成素（EPO）水平。

第二個(gè)氧依賴性機(jī)制發(fā)現(xiàn)于2001年，與HIF-1α的降解無(wú)關(guān)，而是為了抑制HIF-1α作為轉(zhuǎn)錄因子的活動(dòng)。薩門扎的團(tuán)隊(duì)率先識(shí)別出了相關(guān)因子，稱為FIH-1（意為“抑制HIF的因子”）。FIH是一種氧依賴性的羥化酶，可以使HIF-1α和EPAS1氨基端激活域的天冬酰胺殘基（NTAD）羥基化。Murray Whitelaw和Richard Bruick發(fā)現(xiàn)，這種羥基化作用會(huì)干擾p300轉(zhuǎn)錄輔助激活因子的增加。因此，通過(guò)脯氨酸羥化過(guò)程，氧氣不僅促進(jìn)了HIF-1α降解，還可以抑制任何逃脫VHL依賴性降解的HIF-1α或EPAS1的轉(zhuǎn)錄功能。因此，HIF-1α活性的氧依賴性翻譯后抑制具有兩個(gè)獨(dú)立的機(jī)制。這表明，保持合理的HIF水平，以及準(zhǔn)確地調(diào)節(jié)細(xì)胞氧含量是一個(gè)非常精細(xì)的過(guò)程。

HIF調(diào)控途徑的廣泛意義

在氧依賴性機(jī)制發(fā)現(xiàn)之后，許多研究小組的工作揭示了HIF通路的穩(wěn)固性，以及HIF在調(diào)節(jié)受氧影響的基因表達(dá)中的核心作用。從發(fā)現(xiàn)最初的線索以來(lái)，薩門扎、拉特克利夫和凱林一直是該領(lǐng)域的中心人物。他們參與了進(jìn)一步闡明HIF通路的分子生物學(xué)工作，并使我們更深刻理解了缺氧反應(yīng)在健康狀態(tài)和疾病中的生理作用。

脯氨酸羥化酶的發(fā)現(xiàn)啟發(fā)了尋找羥化酶抑制劑，以提高HIF水平的研究，為藥理學(xué)開發(fā)開辟了新的途徑。事實(shí)上，一些通過(guò)抑制脯氨酸羥化酶來(lái)增加HIF功能的潛在藥物已經(jīng)進(jìn)行了很長(zhǎng)時(shí)間的臨床試驗(yàn)，最近的一系列成果也展示了這些藥物在貧血治療中的臨床療效。

抑制HIF通路的未來(lái)應(yīng)用也很有前景。我們或許可以用這些手段來(lái)減緩由VHL突變引起的某些癌癥的發(fā)展。其中之一是EPAS1功能的特異性阻滯劑，最近凱林和同事在動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，該阻滯劑能夠減緩VHL突變細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)。

從藥理上提高HIF的功能可能有助于治療多種疾病，因?yàn)橐延醒芯孔C明，HIF對(duì)免疫功能、軟骨形成和傷口愈合等多種現(xiàn)象至關(guān)重要。另一方面，抑制HIF功能也可以有許多應(yīng)用：許多癌癥以及一些心血管疾?。òㄖ酗L(fēng)、心臟病和肺動(dòng)脈高血壓）中都會(huì)出現(xiàn)HIF水平升高。這些諾貝爾獎(jiǎng)成果的應(yīng)用很可能才剛剛開始，因?yàn)楹苊黠@，細(xì)胞、組織和有機(jī)體對(duì)氧氣的反應(yīng)是動(dòng)物最核心、最重要的生理適應(yīng)之一。